Technische richtlijnen voor het onderzoek van weefselbiopten in neurologische aandoeningen

Instituut Born-Bunge vzw
Prof. Dr. Sc. C. Ceuterick-de Groote
Diensthoofd Laboratorium voor Ultrastructurele Neuropathologie (LUN)

Neuromusculaire Morfologie (Biobank Tf1)
Prof. Dr. Sc. C. Ceuterick-de Groote
Coördinator Neuromusculaire Morfologie

team	meer info
wie contacteren?	meer info
welke patiënt komt in aanmerking?	meer info
versturingsprotocol	meer info
spierbiopt	meer info
zenuwbiopt	meer info
huidbiopt	meer info
conjunctivabiopt	meer info
fixatie- en bufferoplossingen voor EM	meer info
samenvatting	meer info
resultaten	meer info

Team

Diensthoofd en coördinator	Prof. Dr. Sc. C. Ceuterick-de Groote	03 265 26 59	e-mail
Wetenschappelijk consulent biobank	Em. Prof. Dr. J-J. Martin	03 265 26 02	e-mail

Histo-enzymologie en immunohistochemie	Edith Peeters	03 265 26 44	e-mail
Elektronenmicroscopie	Linda De Wit Carola Sales Carbonell	03 265 26 12	e-mail e-mail

Fotolabo	Inge Bats	03 265 26 44	e-mail
Secretariaat Instituut Born-Bunge	Tineke Van Roy	03 265 25 96	e-mail

Wie contacteren

Biopten die afgenomen worden in het UZAntwerpen

• altijd via het Neuromusculair Referentie Centrum - UZAntwerpen

• afspraken te maken via:

Mevr. Iris Smouts	maatschappelijk verpleegkunde	03 821 45 08
Prof. Dr. P. De Jonghe	diensthoofd	03 821 33 45

Biopten die niet afgenomen worden in het UZAntwerpen

• enkel biopt versturen na een persoonlijke afspraak met:

Prof. Dr. C. Ceuterick	diensthoofd	03 265 26 59
of bij afwezigheid:
Laboratorium LUN		03 265 26 12
Secretariaat IBB		03 265 25 96

• gelieve ook minstens één week op voorhand te verwittigen dat er een biopt verstuurd gaat worden

Weefselselectie - welke patiënt komt in aanmerking?

Voor spierziekten komen enkel biopten van patiënten met de volgende aandoeningen in aanmerking voor microscopisch onderzoek:

• congenitale myopathieën

• spierdystrofieën

• metabole myopathieën

• inflammatoire aandoeningen van het type:

- polymyositis

- dermatomyositis

- inclusion body myositis

Voor perifere neuropathieën komen enkel biopten van patiënten met de volgende aandoeningen in aanmerking voor microscopisch onderzoek:

• vasculitiden

• amyloïdosen

Wat de erfelijke neuropathieën betreft:

• steeds op voorhand contact op te nemen met Prof. Dr. P. De Jonghe (03 821 33 45) omdat voorafgaand DNA onderzoek noodzakelijk is.

Huidbiopten: enkel in het kader van een "dienstverlening" met betrekking tot het onderzoek van neurometabole stapelingsziektenen sommige perifere neuropathieën.

Versturingsprotocol

• het labo LUN wordt nogmaals verwittigd op het moment dat de biopsie genomen is en verstuurd gaat worden.

•richtlijnen:

• een volledig klinisch verslag bezorgen/ meesturen; liefst met ons standaard aanvraagformulier

• de technische richtlijnen van de laboratoria opvolgen

• de lokalisatie van het biopt vermelden

• de naam en adres van de personen aan wie een resultaat meegedeeld moet worden opgeven

• een etiket bezorgen met de administratieve en mutualiteitsgegevens (INSZ nummer) van de patiënt

• de biopten steeds op het volgende adres te bezorgen:

Laboratorium voor Ultrastructurele Neuropathologie (+ Neuromusculaire Morfologie)
Gebouw T: gelijkvloers: lokaal 0.02 of 0.04
Campus Drie Eiken (Parking 4)
Universiteit Antwerpen
Universiteitsplein 1
B-2610 Wilrijk

het is uitermate belangrijk het correcte afleveradres te vermelden

Technische richtlijnen

spierbiopt

biopsie procedures

• onder subcutane verdoving met xylocaïne of novocaïne

• grootte van het stuk:

• voor lichtmicroscopie: lengte: 2 cm, breedte 1/2 cm

• voor elektronenmicroscopie: lengte: 1 cm, breedte: 2 mm

• werkwijze:

• eerst het geselecteerde stuk met een bistouri isoleren van de rest van de spier.
Snijden volgens de richting van de vezels

• voor EM: gebruikmaken van een aangepaste tang van Duval (zonder de parallelle klemmen).
Het stuk moet voorzichtig behandeld worden om struktuurveranderingen te vermijden (door bvb. geen tractie uit te oefenen op de spiervezels).
De stukken uitsluitend aan de uiteinden manipuleren met een pincet zonder tandjes.

weefselverwerking

stuk voor lichtmicroscopie (histoenzymologie)

• onmiddellijk in een leeg en hermetisch gesloten potje plaatsen

• potje op een bed van gewone ijsblokjes in een thermos doen

Let op:

• het stuk niet invriezen door gebruik van bvb. C02 of stikstof

• het potje droog houden (geen insijpeling van smeltwater)

• geen uitgedroogd stukje bezorgen

• zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgeven aan de laboratoria

stuk voor klassieke elektronenmicroscopie: 10 mm x 2 mm

• onmiddellijk gefixeerd door overbrenging met de tang in een 4% fosfaatgebufferde glutaaraldehyde-oplossing op frigotemperatuur

• na 5 minuten wordt de tang verwijderd en het weefsel verder gefixeerd in een 4% fosfaatgebufferde glutaaraldehyde-oplossing op frigotemperatuur

• transport: in een thermos gevuld met gewone ijsblokjes

voor immuno-EM zijn er andere verwerkingsmethoden en is het dus best het labo te verwittigen om praktische richtlijnen af te spreken.

Let op:

• uitdroging en bevriezen van het stuk vermijden

• geen gebruik maken van een fysiologische oplossing

• het gebruikte fixatief vermelden op de potjes

• zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgeven aan het laboratorium

verdere verwerking van het spierweefsel voor EM indien de stalen niet onmiddellijk aan het laboratorium kunnen worden afgeleverd

• na 2 u fixatie worden er kleine fragmenten gemaakt met een scheermes

- let op: niet trekken aan de vezels en enkel de uiteinden van het fragment aanraken met een pincet
(deze uiteinden kunnen nadien verwijderd worden)

- verwijderen van vet- en bindweefselkapsels

- snijden in de vezelrichting

- grootte van de fragmenten: 2 mm lengte, 1 mm breedte

• nadien worden de fragmenten opnieuw 2 uur in fixatie gelaten op frigotemperatuur
de ganse fixatie duurt dus in totaal 4 uur.

• vervolgens worden de fragmenten gestockeerd in Millonig buffer waaraan 270 mg D-glucose/50 mg buffer toegevoegd werd

• na 24 uur nogmaals vernieuwen

• de fragmenten kunnen dan tijdelijk bewaard kunnen worden:

- in de koelkast (max. 3 weken)
- voor transport: in een thermos gevuld met ijs

zenuwbiopt

biopsie procedures

• lokalisatie: nervus suralis (uitzonderlijk en na grondige bespreking kunnen ook de nervus fibularis superficialis of sensiebele tak van de nervus radialis onderzocht worden)

• onder lokale verdoving met xylocaïne of novocaïne: retromalleolair, gedeeltelijke anesthesie van de zenuw boven het biopt (proximaal); onderscheid te maken tussen de vena saphena parva en de nervus suralis: witte kleur van de zenuw, schuine vertakking van zenuwbundeltjes en dysesthesieën thv de zijkant van de voet bij het snijden bevestigen dat het hier om een zenuw gaat. Blauwe kleur, loodrechte vertakking van bloedvaten en afwezigheid van dysesthesieën thv de zijkant van de voet bij het snijden, zijn indicaties dat het hier om de vena saphena parva gaat. Let op: een gethromboseerde vena saphena parva kan het uitzicht van een zenuw hebben maar er zijn GEEN DYSESTHESIEEN BIJ HET SNIJDEN.

• lengte van het stuk:

• voor lichtmicroscopie: 3 cm

• voor elektronenmicroscopie: 2 cm

• voor genetica (steriel buisje) : 1 cm

• werkwijze:

• met een pincet zonder tandjes

• eerst het proximale gedeelte doorsnijden en dan distaal:

- een volledige sectie is aanbevolen
- een fasciculaire biopsie is af te raden: geeft complicaties voor de patient

weefselverwerking

stuk voor lichtmicroscopie (histoenzymologie)

• onmiddellijk in een leeg en hermetisch gesloten potje plaatsen

• potje op een bed van gewone ijsblokjes in een thermos doen

Let op:

• het stuk niet invriezen door gebruik van bvb C02 of stikstof

• het potje droog houden (geen insijpeling van smeltwater)

• geen uitgedroogd stukje bezorgen

• zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgeven aan de laboratoria

stuk voor klassieke elektronenmicroscopie: 20 mm x 2 mm

• onmiddellijk gefixeerd in een 4% fosfaatgebufferde glutaaraldehyde-oplossing op frigotemperatuur

• transport: in een thermos gevuld met gewone ijsblokjes

Let op:

• uitdroging en bevriezen van het stuk vermijden

• geen gebruik maken van een fysiologische oplossing

• het gebruikte fixatief vermelden op de potjes

• zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgeven aan het laboratorium

verdere verwerking van het zenuwweefsel voor EM indien de stalen niet onmiddellijk aan het laboratorium kunnen worden afgeleverd

• na 2 u fixatie worden er kleine fragmenten gemaakt met een scheermes

- let op: niet trekken aan de vezels en enkel de uiteinden van het fragment aanraken met een pincet
(deze uiteinden kunnen nadien verwijderd worden)

- verwijderen van vet- en bindweefselkapsels

- snijden in de vezelrichting

- grootte van de fragmenten: 2 mm lengte, 1 mm breedte

• nadien worden de fragmenten opnieuw 2 uur in fixatie gelaten op frigotemperatuur
de ganse fixatie duurt dus in totaal 4 uur.

• vervolgens worden de fragmenten gestockeerd in Millonig buffer waaraan 270 mg D-glucose/50 mg buffer toegevoegd werd

• na 24 uur nogmaals vernieuwen

• de fragmenten kunnen dan tijdelijk bewaard kunnen worden:

- in de koelkast (max. 3 weken)

- voor transport: in een thermos gevuld met ijs

huidbiopt

biopsie procedures: "punch biopt"

• fragment: max. afmetingen: 1 mm x 1 mm x 5 mm

• lokalisatie: meestal gepreleveerd ter hoogte van

• de schouder

• de axilla (voor een "polyglucosan body disease" of een ziekte van Lafora)

•onder lokale verdoving met xylocaïne 1 %

• werkwijze

• afgenomen door een dermatoloog d.m.v. de "skin punchbiopsie" techniek

• het biopt moet diep genoeg gaan om ook dermis en hypodermis te bevatten

• het afgenomen stuk huid wordt onmiddellijk in het juiste fixatief (4% fosfaatgebufferde glutaaraldehyde-oplossing, geen fysiologische oplossing!) overgebracht
- hechtingen zijn overbodig.
- "Steristrips" worden gebruikt om het wondje dicht te plakken.

• voor immuno-EM: afspraak met Labo LUN.

weefselverwerking

stuk voor elektronenmicroscopie: max. afmetingen: 1 mm x 1 mm x 5 mm

• het fragment wordt in fixatief: 4% glutaaraldehyde gebufferd met 0.1 M fosfaatbuffer gebracht op frigotemperatuur en zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgegeven aan het laboratorium

• transport: in een thermos gevuld met gewone ijsblokjes

• na 2 u worden er kleine fragmenten gemaakt (1 mm x 1 mm x 2 mm)

• loodrecht snijden met een scheermes, om tegelijkertijd epidermis, dermis en hypodermis te hebben in alle fragmenten

• opnieuw 2 u fixeren in 4% glutaaraldehyde gebufferd met 0.1 M fosfaatbuffer op 4°C

• na 4 u fixatie: worden de stukjes 2 x 5 minuten gespoeld met fosfaatbuffer waaraan sucrose is toegevoegd en waarin ze tijdelijk bewaard kunnen worden:
- in de koelkast (max. 3 weken)
- voor transport: in een thermos gevuld met ijs

conjunctivabiopt

biopsie procedures

Na het aanbrengen van een verdovend collyrium wordt het conjunctivabiopt (enkele mm groot) onder een ooglid genomen met pincet en schaar.
Hechtingen zijn overbodig.

weefselverwerking

stuk voor elektronenmicroscopie: enkele mm groot

• het fragment wordt in fixatief: 4% glutaaraldehyde gebufferd met 0.1 M fosfaatbuffer gebracht op frigotemperatuur en zo snel mogelijk (max. 2 uur) afgegeven aan het laboratorium

• transport: in een thermos gevuld met gewone ijsblokjes

• na 2 u worden er kleine fragmenten gemaakt (1 mm x 1 mm x 2 mm)

• loodrecht snijden met een scheermes, om tegelijkertijd epidermis, dermis en hypodermis te hebben in alle fragmenten

• opnieuw 2 u fixeren in 4% glutaaraldehyde gebufferd met 0.1 M fosfaatbuffer op 4°C

Fixatie- en bufferoplossingen voor EM

MILLONIG Buffer: 01 M; pH 7.4 (P04) te bewaren op frigotemperatuur

• deze buffer bestaat uit 2 componenten:

oplossing A:	2.260g NaH2P04 1H20/ 100 ml ABD
of	2.546g NaH2P04 2H20/ 100 ml ABD
oplossing B:	2.520g NaOH/ 100 ml ABD
Bufferoplossing	83 ml opl.A + 17 ml opl. B
	100 ml Millonigbuffer met pH 7.4

• pH eventueel aanpassen met opl. A of oplos. B tot pH 7.35 ----7.4

• ABD = bigedistilleerd water

Fixatief glutaaraldehyde (Gluta)

• te bewaren op frigotemperatuur

• ampul van 2 ml gluta 70% verdunnen met 33 ml Millonig buffer tot eindconcentratie van 4%

• eveneens pH controleren en zonodig aanpassen met één der componenten van de Millonig buffer
deze oplossing blijft goed gedurende ± 2 weken mits controle van de pH

• gebruik best ’Glutaaraldehyde van LADD’
(ref. 20100 Ladd catalog; 70% concentratie 2ml ampules in doos van 10 ampules)

• verdeler Comptoir Scientifique Belge pvba CSB Veldstraat 20 B-1860 Meise TEL: 02 269 26 93

Samenvatting

Een spier- en/ of zenuw biopsie moet 2 stukken inhouden:

• 1 stuk voor histoenzymologie. Dit stuk moet droog blijven. Dus niet invriezen en niet in fixatief overbrengen.

• 1 stuk voor elektronenmicroscopie. Dit stuk moet onmiddellijk in glutaaraldehyde worden overgebracht. Geen fysiologisch serum gebruiken. Fixatief kan afgehaald worden in het labo LUN (tel: 03 265 26 12). Voor immuno-EM: afspraak met het labo LUN.

Een huid en/ of conjunctiva:

• wordt onmiddellijk in glutaaraldehyde overgebracht voor elektronenmicroscopie. Geen fysiologisch serum gebruiken. Fixatief kan afgehaald worden in het labo LUN (tel: 03 265 26 12) indien het niet kan bekomen worden op de dienst algemene pathologie van eigen ziekenhuis.

Mededeling van de resultaten

Spier / zenuw

Voor een biopsie waarvan wij een volledig klinisch verslag samen met het adres en het INSZ nummer van de patient ontvingen:

• histoenzymologisch verslag: binnen de 8 dagen na ontvangst van de biopsie

• immunohistochemisch verslag (op indicatie): 2 weken na ontvangst van de biopsie

• elektronenmicroscopisch verslag: 3 tot 6 maanden, afhankelijk van de lichtmicroscopische resultaten en van de maandelijkse, gezamenlijke verwerking van de stalen

Huid / conjunctiva

Voor een biopsie waarvan wij een volledig klinisch verslag samen met het adres en het INSZ nummer van de patient ontvingen:

• elektronenmicroscopisch verslag: 3 tot 12 maanden